寻常痤疮患者外周血单核细胞TLR2的表达及IL8TNFα水平变化.doc
刘波 胡友红
[摘要]目的：检测痤疮患者外周血TLR-2、IL-4、IL-8、TNF-α的水平，并分析这些因素与痤疮严重程度的相关性。方法：收集本院皮肤科门诊收治的寻常性痤疮患者90例，轻、中、重度患者各30例，另选择30例健康者作为对照组。流式细胞仪检测外周血CD14+单核细胞TLR-2表达，双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清IL-4、IL-8、TNF-α水平。结果：三组痤疮患者TLR-2、IL-4、IL-8及TNF-α表达均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），且均与痤疮严重程度呈正相关（P<0.05）。结论：痤疮患者外周血TLR-2、IL-4、IL-8、TNF-α的检测可指导痤疮严重程度的客观评价和临床治疗。
[关键词]痤疮；TOLL样受体；白介素-4；白介素-8；肿瘤坏死因子-α
[中图分类号]R758.73+3 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）03-0111-03
The Correlation Study between the Expression of TLR-2， IL-4， IL-8， TNF-α and the Severity of Acne in Acne Patients
LIU Bo1，2，HU You-hong2
（1.The Basic Medical School of Wuhan University，Wuhan 430071，Hubei，China；2.Department of Dermatology，Xiaogan Central Hospital，Xiaogan Hospital Affiliated to Wuhan University of Science and Technology，Xiaogan 432000，Hubei，China）
Abstract： Objective To explore the role of TLR-2， IL-4， IL-8 and TNF-α in the pathogenesis of acne vulgaris， and analyze the correlation between these factors and the severity of the clinical manifestations of acne. Methods Venous blood was collected from 30 human controls and 90 patients with acne vulgaris， the patients were divided into three groups， mild， moderate and severe group. TLR-2 expression of CD14+ monocyte in peripheral blood of flow cytometry and the level of IL-4， IL-8 and TNF-α in serum by double antibody enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. Results The expression of TLR-2， IL-4， IL-8 and TNF-α in three groups of acne patients were all higher than those of the control group， and the difference were statistically significant（P<0.05）. And which was positively correlated with the severity of acne（P<0.05）. Conclusion The detection of TLR-2， IL-4， IL-8 and TNF-α in the peripheral blood of acne patients can guide the objective evaluation and clinical treatment of the severity of acne.
Key words： acne vulgaris； Toll-like receptors； IL-4； IL-8； Tumor necrosis factor-α
痤瘡的发病机制主要包括：皮肤毛囊皮脂腺导管角化异常，微生物的感染尤其丙酸痤疮杆菌定植，以及免疫学因素[1]。痤疮丙酸杆菌的定植可诱导机体一系列免疫反应，但其具体应答机制尚未明确，近年来研究发现[2]，天然免疫是痤疮粉刺的形成，继发性炎症的起始和加重因素，病原相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）及其模式识别受体是天然免疫重要机制之一。痤疮丙酸杆菌可通过Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）依赖途经激活单核细胞，从而释放白介素等细胞因子引起炎症。研究发现[3-4]痤疮患者外周血单核细胞TLR-2的表达上调，及其与IL-8和TNF-α等炎性因子相关。同时，大量研究表明[5]，特异性免疫应答也参与痤疮的发生和发展过程，并存在免疫应答异常，表现为Th2细胞介导占主导地位，IL-4为Th2细胞释放的重要炎性因子。本次联合检测痤疮患者TLR-2以及炎性因子IL-4、IL-8、TNF-α的表达水平，并分析这些因素与不同临床程度痤疮的相关性，现报道如下。
1 资料和方法
1.1 一般资料：参考赵辨主编的《中国临床皮肤病学》寻常性痤疮诊断标准，收集2017年3月-2017年10月本院皮肤科门诊收治的寻常性痤疮患者90例，其中男42例，女48例；年龄15～39岁，平均（18.23±5.65）岁；病程3个月～22年，平均（3.58±1.24）年。参照Pillsbury分类法，根据患者皮损数目痤疮分Ⅰ～Ⅳ级，Ⅰ级为轻度组，Ⅱ～Ⅲ级为中度组，Ⅳ级为重度组。轻度组（Ⅰ级）30例，男19例，女11例，年龄（17.46±4.25）岁，病程（3.04±1.11）年；中度组（Ⅱ～Ⅲ级）30例，男12例，女18例，年龄（18.27±5.44）岁，病程（2.89±1.04）年；重度组（Ⅳ级）30例，男11例，女19例，年龄（19.44±5.24）岁，病程（3.20±1.09）年。另外，同期随机选择本院体检中心健康志愿者30例为对照组，其中男18例，女12例，年龄（18.11±4.33）岁。各组性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本试验进行前经医院伦理委员会审核批准并备案，所有参试者均为自愿参与，且事前均被告知研究事项并签署知情同意书。
1.2 纳入标准：①男女不限，自愿参加者；②无自身免疫性疾病者；③近1个月内系统及局部未使用维A酸类、糖皮质激素等药物者；④非药物性、职业性及经期前痤疮者。
1.3 方法
1.3.1 仪器和试剂：FACSCAL-IBUR流式细胞仪（美国BD公司）；FITC荧光素标记小鼠抗人CD14抗体，藻红蛋白（PE）标记小鼠抗人TLR2抗体及同型对照鼠抗人IgG抗体，1×红细胞裂解液，均购自eBioscience公司；血清IL-4、IL-8、TNF-α检测试剂盒均购自上海信裕生物科技有限公司。
1.3.2 标本采集及处理：所有参试者均晨间空腹采集肘静脉血5ml，其中3ml全血置于肝素抗凝管中，4℃冰箱保存，待流式细胞仪检测；另2ml置于消毒试管中，低温离心15min（2 500r/min），吸取上清液分装于Eppendorf管中，置-20℃冰箱保存待检。
1.3.3 流式细胞仪检测外周血CD14+单核细胞TLR-2表达：每份参试者标本各取3支样品测定管，依次加入相应抗体CDl4-FITC，IgG1-FITC/IgG2a-PE，CDl4-FITC/TLR2-FITC 20μl，然后在每管中加入该份参试者抗凝血100μl，振荡混匀，室温避光孵育20mim后加入2ml溶血素，振荡混匀，室温避光5min，然后1 000r/min离心5min，弃去上清液后加PBS 2ml，再1 000r/min离心5min后弃上清液；加入PBS 300μl混匀，上机检测，同时设不加标记抗體的阴性对照管。上机前以标准荧光微球调整仪器的变异系数并稳定在2%以内，上机收集10 000个细胞/管，荧光强度以对数放大，光散射数据存盘，测试完成后用CellQuest软件检测，以CD14及TLR-2抗体染色双阳性细胞百分率记录结果。
1.3.4 血清IL-4、IL-8、TNF-α的检测：均采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA），操作步骤严格按照试剂盒说明进行。
1.4 统计学分析：所有数据用SPSS 19.0统计软件包进行分析。实验测定计量资料数用（x?±s）表示，组间比较行t检验，方差不齐，选用近似t检验。TLR-2及IL-4、IL-8、TNF-α表达水平与痤疮严重程度分级相关采用Spearman分析，用直线相关分析法处理指标间关系。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 外周血CD14+单核细胞TLR-2表达的检测结果：轻、中、重度痤疮患者外周血中的TLR-2表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；90例痤疮患者TLR-2表达水平与痤疮严重程度呈正相关（r=0.485，P<0.05）。见表1。
2.2 血清IL-4、IL-8、TNF-α检测结果：轻、中、重度痤疮患者外周血中的IL-4、IL-8、TNF-α水平均明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。90例痤疮患者IL-4、IL-8、TNF-α的表达水平与轻、中、重度痤疮相关性呈正相（r=0.489，P<0.05；r=0.424，P<0.05；r=0.432，P<0.05）。见表1。
3 讨论
痤疮好发于颜面部、胸背部等皮脂腺分布密集的区域，是一种多因素疾病，其主要病因为皮脂过多分泌、毛囊皮脂腺导管堵塞、细菌感染和炎症，大量皮脂的分泌和排出障碍易继发细菌感染，最常见和最重要的是痤疮丙酸杆菌的感染。痤疮丙酸杆菌，为人类皮肤共生菌之一，分布于皮脂分泌旺盛的区域，丙酸杆菌繁殖后激活炎症反应，为痤疮粉刺、炎性丘疹的起始或加重环节，但其激活炎症反应机制尚未完全阐明[6]。
在病原体入侵时，通过病原相关模式分子（pathogen associated molecular patterns， PAMP）与固有免疫细胞其表面的或者胞质中的模式识别受体（pattern recognition receptor， PRR）识别，相互结合后即可迅速激活效应细胞，一并启动下游一系列免疫反应，触发机体的固有免疫[7]。TLR为重要的一类PRR，在生物界广泛表达，是天然免疫中抗感染免疫重要机制之一，痤疮丙酸杆菌的PAMP可识别角质形成细胞和皮脂腺细胞表达的TLR-2等受体，触发天然免疫，刺激角质形成细胞产生一系列炎性因子[8-9]。房晶晶等[2]应用流式细胞术检测到痤疮患者外周血CD14+单核细胞TLR-2的表达增强，痤疮外周血CD14+单核细胞TLR-2经异维A酸[10]、强脉冲光联合甲硝唑[11]、中药面膜验方[12]等治疗后，表达可下调。研究发现，痤疮患者外周血CD14+单核细胞TLR-2的表达上调，并且与痤疮的严重程度呈正相关。
早期痤疮患者外周血单核细胞TLR-2等受体识别病原菌后，激活NF-κB信号通路，启动IL-8、TNF-α表达，直接介导炎症反应，并且在局部招募多种炎症细胞并促进其他炎症介质的释放、造成炎症反应的级联激活[13]。随着病情的持续发展，炎性因子释放和聚集可加重痤疮的炎性反应，甚至促进新的痤疮样皮损形成[14]。同时，由于痤疮患者存在以Th2细胞介导占主导地位的免疫应答异常，Th2细胞释放大量IL-4等因子促进B细胞介导的体液免疫。在痤疮早期患者中丙酸杆菌细胞壁糖类以产生不能渗入毛囊为主的IgM抗体，当抗原持续存在时以产生能渗入毛囊并激活补体的IgG抗体为主，并进入毛囊皮脂腺参与痤疮的病理过程。本次研究发现，痤疮患者外周血TLR-2、IL-4、IL-8、TNF-α表达同时上升，与痤疮的严重程度呈正相关。
总之，TLR-2表达上调，以及IL-4、IL-8、TNF-α炎症因子局部或外周血增加，可能是痤疮炎症反应的分子途径，通过检测这些炎症因子，可指导痤疮炎症反应程度的客观评价，同时还能根据痤疮患者的免疫应答状态，及时在治疗过程中采取相应措施控制痤疮患者过度的免疫反应，减少因炎性因子过度释放引起的后遗症和病理改变，以利于提高临床治疗效果和改善患者生活质量。但轻、中以及重度各级别痤疮的以上炎症因子的具体标准范围，仍需进一步观察和研究。
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[收稿日期]2017-12-21 [修回日期]2018-02-02
编辑/朱婉蓉
